
<html>

<head>

<meta http-equiv="Content-Type" content="text/html; charset=iso-8859-1">

<style type="text/css" style="display:none;"><!-- P {margin-top:0;margin-bottom:0;} --></style>

</head>

<body dir="ltr">

<div id="divtagdefaultwrapper" style="font-size:12pt;color:#000000;font-family:Calibri,Helvetica,sans-serif;" dir="ltr">

<p></p>

<p class="p1" style="margin-right: 0px; margin-left: 0px; font-variant-numeric: normal; font-variant-east-asian: normal; font-variant-alternates: normal; font-kerning: auto; font-optical-sizing: auto; font-feature-settings: normal; font-variation-settings: normal; font-stretch: normal; font-size: 12px; line-height: normal; font-family: Helvetica;">

</p>

<div>Hi everyone</div>

<div><br>

</div>

<div>I am processing a dataset in Relion 4 that is giving me some issues.</div>

<div>After CTF refining, the particles were not aligning anymore upon 3D refinement. Therefore I tried 3D-refining after each CTF step and I figured out the problem was the 4th order aberrations paramenter: when set to No, refinement was then working correctly

 (I didn´t use trefoil estimation).</div>

<div>However, after I do bayesian polishing, the 3D refinement gives the same problem, i.e. it is not able to align the particles (the job results in a random bowl of density, empty inside.</div>

<div>In order to overcome this, I tried several approaches: I tried polishing with and without training on the particles, I regrouped them, I changed box size, I changed workstation and I also did the job on the whole particle and on a focused area (the particle

 is a ribosome). I also tried to make the refinement process easier for Relion, keeping the reference not so much low-pass filtered (at this stage it is difficult to bias the result), adding maxsig 3000 as additional argument, using a mask and skipping padding

 and gridding.</div>

<div>Nothing of this worked and I don´t know how to proceed.</div>

<div><br>

</div>

<div>Has anyone ever had this kind of problem and know how to solve it?</div>

<div>Thank you for your time</div>

<div>- Martino</div>

<br>

<p></p>

</div>

</body>

</html>