<div dir="ltr"><div>Hi Omid,</div><div><br></div><div>We recently had a very complicated case of reference bias: using a rotationally-symmetric reference image to pick spherical viruses sounds a logical thing to do does'nt it? However, it actually caused the data set to split into two: We got two 3D reconstructions differing in size by 0.9%.  It took me more than a week to understand that that disparity was caused 
primarily 

by the picking of elliptical particles (2.6% anisotropic magnification) using a rotationally-symmetric reference. It was a very tricky case of reference bias...  So don't expect me to explain the nitty gritty details in less than 10 lines of email. Bottom line: our correction algorithm (see paper) took fully care of it.  The underlying problem was that we had not seriously looked at anisotropy due to an entirely different issue that obscured the data: our Cs-corrected Krios suffered from wild unpredictable astigmatism fluctuations during data collection (up to 1 micron!), for almost three months. Only after that issue was resolved did I even try to measure anisotropic magnification. <br></div><div>Hope this helps,</div><div><br></div><div>Marin <br></div><div><br></div></div><br><div class="gmail_quote"><div dir="ltr" class="gmail_attr">On Tue, Jan 21, 2020 at 7:19 PM Haji-Ghassemi, Omid <<a href="mailto:omidgh85@mail.ubc.ca">omidgh85@mail.ubc.ca</a>> wrote:<br></div><blockquote class="gmail_quote" style="margin:0px 0px 0px 0.8ex;border-left:1px solid rgb(204,204,204);padding-left:1ex">





<div lang="EN-CA">
<div class="gmail-m_-4878658318407406635WordSection1">
<p class="MsoNormal"><span style="font-size:12pt;font-family:"Times New Roman",serif;color:black">Dear Marin,<u></u><u></u></span></p>
<p class="MsoNormal"><span style="font-size:12pt;font-family:"Times New Roman",serif;color:black"><u></u> <u></u></span></p>
<p class="MsoNormal"><span style="font-size:12pt;font-family:"Times New Roman",serif;color:black">Hope your are doing well and thanks again for a memorable time in Brazil
</span><span style="font-size:12pt;font-family:"Segoe UI Emoji",sans-serif;color:black">😊</span><span style="font-size:12pt;font-family:"Times New Roman",serif;color:black">. I apologize for the delay
 in response and I really appreciate your suggestion. It makes sense that anisotropic magnification is best performed on the initial movie stacks but I don’t think I completely comprehend how
</span><span style="font-size:12pt;font-family:"Times New Roman",serif">anistropic magnification correction lead to bias during picking if it is done after the initial processing (since the picking is now done anyway). Can you clarify?
<u></u><u></u></span></p>
<p class="MsoNormal"><span style="font-size:12pt;font-family:"Times New Roman",serif"><u></u> <u></u></span></p>
<p class="MsoNormal"><span style="font-size:12pt;font-family:"Times New Roman",serif">Best,<u></u><u></u></span></p>
<p class="MsoNormal"><span style="font-size:12pt;font-family:"Times New Roman",serif">Omid<u></u><u></u></span></p>
<p class="MsoNormal"><span style="font-size:12pt;font-family:"Times New Roman",serif;color:black"><u></u> <u></u></span></p>
<p class="MsoNormal"><b><span lang="EN-US">From:</span></b><span lang="EN-US"> Marin van Heel <<a href="mailto:marin.vanheel@googlemail.com" target="_blank">marin.vanheel@googlemail.com</a>>
<br>
<b>Sent:</b> January 17, 2020 8:54 AM<br>
<b>To:</b> Haji-Ghassemi, Omid <<a href="mailto:omidgh85@mail.ubc.ca" target="_blank">omidgh85@mail.ubc.ca</a>>; 3dem <<a href="mailto:3dem@ncmir.ucsd.edu" target="_blank">3dem@ncmir.ucsd.edu</a>>; <a href="mailto:ccpem@jiscmail.ac.uk" target="_blank">ccpem@jiscmail.ac.uk</a><br>
<b>Subject:</b> Re: [ccpem] Relion 3.1 CtfRefine anisotropic magnification<u></u><u></u></span></p>
<p class="MsoNormal"><u></u> <u></u></p>
<div>
<div>
<div>
<p class="MsoNormal">Dear Omid,<u></u><u></u></p>
</div>
<div>
<p class="MsoNormal"><u></u> <u></u></p>
</div>
<div>
<p class="MsoNormal">Anisotropic magnification should be corrected first, even before any CTF determination, since its presence messes up the defocus/astigmatism assessment. The anisotropic magnification measurement is best/conveniently performed on the movie
 data itself. It does not require any separate calibration measurements since the water ring information is always present in large cryo-EM datasets, and those contain all the necessary anisotropy information. The Imagic procedures allow you to a posteriori
 correct anistropic magnification even in "legacy" cryo-EM datasets. Depending on how you perform the correction, the average pixel size may change, and consistency is important. It is not a good idea to do this anisotropic magnification correction as an "afterthought"
 at the late stages of refinement since it may bias other intermediate processing steps like particle picking.<u></u><u></u></p>
</div>
<div>
<p class="MsoNormal">We have described the procedure extensively in:  <u></u><u></u></p>
<p class="gmail-m_-4878658318407406635gmail-msolistparagraph" style="margin-right:0cm;margin-left:8.5pt;margin-bottom:0.0001pt;text-align:justify">
<span style="font-size:7pt;font-family:"Times New Roman",serif"> </span><span style="font-family:"Times New Roman",serif">Afanasyev P, Seer-Linnemayr C, Ravelli RBG, Matadeen R, De Carlo S, Alewijnse B, Portugal RV, Pannu NS, Schatz M, van Heel M:
<b>Single-particle cryo-EM using alignment by classification (ABC): the structure of Lumbricus terrestris hemoglobin</b>,
<i>IUCrJ. </i><b>4</b> (2017) 678-694.</span><u></u><u></u></p>
<p class="gmail-m_-4878658318407406635gmail-msolistparagraph" style="margin-right:0cm;margin-left:8.5pt;margin-bottom:0.0001pt;text-align:justify">
<u></u> <u></u></p>
<p class="gmail-m_-4878658318407406635gmail-msolistparagraph" style="margin-right:0cm;margin-left:8.5pt;margin-bottom:0.0001pt;text-align:justify">
Hope this helps,<u></u><u></u></p>
<p class="gmail-m_-4878658318407406635gmail-msolistparagraph" style="margin-right:0cm;margin-left:8.5pt;margin-bottom:0.0001pt;text-align:justify">
<u></u> <u></u></p>
<p class="gmail-m_-4878658318407406635gmail-msolistparagraph" style="margin-right:0cm;margin-left:8.5pt;margin-bottom:0.0001pt;text-align:justify">
Marin van Heel<u></u><u></u></p>
</div>
</div>
<p class="MsoNormal"><u></u> <u></u></p>
<div>
<div>
<p class="MsoNormal">On Tue, Dec 24, 2019 at 7:30 PM Haji-Ghassemi, Omid <<a href="mailto:omidgh85@mail.ubc.ca" target="_blank">omidgh85@mail.ubc.ca</a>> wrote:<u></u><u></u></p>
</div>
<blockquote style="border-color:currentcolor currentcolor currentcolor rgb(204,204,204);border-style:none none none solid;border-width:medium medium medium 1pt;padding:0cm 0cm 0cm 6pt;margin-left:4.8pt;margin-right:0cm">
<div>
<div>
<p class="MsoNormal"><span style="font-size:12pt;font-family:"Times New Roman",serif">Dear All,</span><u></u><u></u></p>
<p class="MsoNormal"><span style="font-size:12pt;font-family:"Times New Roman",serif"> </span><u></u><u></u></p>
<p class="MsoNormal"><span style="font-size:12pt;font-family:"Times New Roman",serif">I recently tried estimating the anisotropic magnification via CtfRefine in Relion 3.1 and I get the following
 warning once the run was finished:</span><u></u><u></u></p>
<p class="MsoNormal"><span style="font-size:12pt;font-family:"Times New Roman",serif">WARNING: Overall magnification of optics group #1 (opticsGroup1) differs from the nominal pixel size by 1.92044
 %.</span><u></u><u></u></p>
<p class="MsoNormal"><span style="font-size:12pt;font-family:"Times New Roman",serif">WARNING: This overall difference changes the actual pixel size of the reconstruction!</span><u></u><u></u></p>
<p class="MsoNormal"><span style="font-size:12pt;font-family:"Times New Roman",serif"> </span><u></u><u></u></p>
<p class="MsoNormal"><span style="font-size:12pt;font-family:"Times New Roman",serif">I also attached the resulting log pdf file.
</span><u></u><u></u></p>
<p class="MsoNormal"><span style="font-size:12pt;font-family:"Times New Roman",serif">I then notice subsequent 3D refinement yielded strange 3D volume and really poor data quality. I have refined
 this dataset before and I obtain a resolution of ~-3.8-3.9 Ang. I also attempted to calibrate the pixel size on a region of the map where the resolution is the highest, and my pixel size seemed correct. The pixel size of the data is supposed to be around 1.08
 or 1.09. </span><u></u><u></u></p>
<p class="MsoNormal"><span style="font-size:12pt;font-family:"Times New Roman",serif"> </span><u></u><u></u></p>
<p class="MsoNormal"><span style="font-size:12pt;font-family:"Times New Roman",serif">So my questions are as follows:</span><u></u><u></u></p>
<p class="MsoNormal"><span style="font-size:12pt;font-family:"Times New Roman",serif">1. Up to what resolutions can the anisotropic magnification be detected?
</span><u></u><u></u></p>
<p class="MsoNormal"><span style="font-size:12pt;font-family:"Times New Roman",serif">2. If indeed the data suffers from some degree of pixel error or magnification issues, do I need to adjust it
 manually before submitting the next refinement job? I assumed the correction is already applied after the CtfRefine job. If so where is this information recorded? The pixel size remained the same in the .star file of the header.
</span><u></u><u></u></p>
<p class="MsoNormal"><span style="font-size:12pt;font-family:"Times New Roman",serif">3. How do I analyze the log file data? It was not clear to me from after consulting the tutorial and the paper
 by Zivanov et al., 2019. </span><u></u><u></u></p>
<p class="MsoNormal"><span style="font-size:12pt;font-family:"Times New Roman",serif"> </span><u></u><u></u></p>
<p class="MsoNormal"><span style="font-size:12pt;font-family:"Times New Roman",serif">Regards,</span><u></u><u></u></p>
<p class="MsoNormal"><span style="font-size:12pt;font-family:"Times New Roman",serif">Omid</span><u></u><u></u></p>
<p class="MsoNormal"><span style="font-size:12pt;font-family:"Times New Roman",serif">---------------------------------------------------</span><u></u><u></u></p>
<p class="MsoNormal"><span style="font-size:12pt;font-family:"Times New Roman",serif">---------------------------------------------------</span><u></u><u></u></p>
<p class="MsoNormal"><span style="font-size:12pt;font-family:"Times New Roman",serif">Omid Haji-Ghassemi, Ph.D.</span><u></u><u></u></p>
<p class="MsoNormal"><span style="font-size:12pt;font-family:"Times New Roman",serif">Postdoctoral Fellow</span><u></u><u></u></p>
<p class="MsoNormal"><span style="font-size:12pt;font-family:"Times New Roman",serif">Department of Biochemistry & Molecular Biology</span><u></u><u></u></p>
<p class="MsoNormal"><span style="font-size:12pt;font-family:"Times New Roman",serif">Faculty of Medicine</span><u></u><u></u></p>
<p class="MsoNormal"><span style="font-size:12pt;font-family:"Times New Roman",serif">University of British Columbia</span><u></u><u></u></p>
<p class="MsoNormal"><span style="font-size:12pt;font-family:"Times New Roman",serif">2350 Health Sciences Mall</span><u></u><u></u></p>
<p class="MsoNormal"><span style="font-size:12pt;font-family:"Times New Roman",serif">Vancouver, BC, V6T 1Z3</span><u></u><u></u></p>
<p class="MsoNormal"><span style="font-size:12pt;font-family:"Times New Roman",serif">Canada</span><u></u><u></u></p>
<p class="MsoNormal"> <u></u><u></u></p>
</div>
</div>
<p class="MsoNormal"><u></u> <u></u></p>
<div class="MsoNormal" style="text-align:center" align="center">
<hr width="100%" size="2" align="center">
</div>
<p style="text-align:center" align="center">To unsubscribe from the CCPEM list, click the following link:<br>
<a href="https://www.jiscmail.ac.uk/cgi-bin/webadmin?SUBED1=CCPEM&A=1" target="_blank">https://www.jiscmail.ac.uk/cgi-bin/webadmin?SUBED1=CCPEM&A=1</a>
<u></u><u></u></p>
</blockquote>
</div>
</div>
</div>
</div>

</blockquote></div>