<div dir="ltr">Hi Mohamed,<div>I would suggest the following.</div><div>1- Look at the pI of your protein and try to adjust the pH of you buffer to give your sample a net negative charge.</div><div>2- Screen a number of detergents at multiple concentrations, i.e. 1x CMC, 0.75x CMC, 0.5x CMC (salt concentrations can effect the CMC of your detergent, which in turn will effect how many detergent monomers are available to bind to the air-water interface).</div><div>The detergents that I screen include a couple of anionics, a couple of cationics, a couple of nonionics, and a couple of zwittergents (i.e. Fl Fos Choline, CTAB, DOC, LDAO, CHAPSO, Tween20, DDM, OG).</div><div>3- You could also look at other potential additives to mask surface charge both on your sample, on the grid surface, and at the air-water interface.</div><div><br></div><div>Happy to converse more about this.</div><div><br></div><div>Cheers,</div><div>Chris</div></div><br><div class="gmail_quote"><div dir="ltr" class="gmail_attr">On Thu, May 30, 2019 at 10:26 AM Mohamed A Sayed <<a href="mailto:mohamed.sobhy@kaust.edu.sa">mohamed.sobhy@kaust.edu.sa</a>> wrote:<br></div><blockquote class="gmail_quote" style="margin:0px 0px 0px 0.8ex;border-left:1px solid rgb(204,204,204);padding-left:1ex">




<div dir="ltr" style="font-size:12pt;color:rgb(0,0,0);background-color:rgb(255,255,255);font-family:Calibri,Arial,Helvetica,sans-serif">
<p>If you would please advise on the following:<br>
</p>
<p>I have protein that shows strong preferential orientation. The buffer only contains (20 mM Tris. HCl pH7.5, 150 mM NaCl). </p>
<p>I tried adding detergent CHAPS (8 mM final concentration) and the number of particles dropped to only a few per hole and most of the protein particels were on the carbon film. <span style="font-family:Calibri,Arial,Helvetica,sans-serif;font-size:16px;background-color:rgb(255,255,255)">I
 tried different hole size gold grids r</span><span style="font-family:Calibri,Arial,Helvetica,sans-serif;font-size:16px;background-color:rgb(255,255,255)">1.2/1.3</span><span style="font-family:Calibri,Arial,Helvetica,sans-serif;font-size:16px;background-color:rgb(255,255,255)"> and
 r</span><span style="font-family:Calibri,Arial,Helvetica,sans-serif;font-size:16px;background-color:rgb(255,255,255)">2/2 but the same result. Any advice how to obtain random distribution in such case.</span></p>
<p><br>
</p>
<p>Is there an adjustment in Relion 3d classification parameters in order to obtain a 3d classification? I tried without symmetry and both the initial model and 3d classifcation fail. <br>
</p>
<p><span style="font-size:12pt">number of classes</span><br>
</p>
<p><span style="font-size:11.5pt;line-height:107%;font-family:"Segoe UI",sans-serif;color:rgb(33,33,33)">Initial angular sampling</span><br>
</p>
<p>symmetry<br>
</p>
<p>CTF correction  or  'Ignore CTF’s until first peak'.</p>
<p><span style="font-size:12pt">'Initial angular sampling'.</span></p>
<p>mask​<br>
</p>
<p>SGD:<br>
</p>
<p>Final resolution<br>
</p>
<p>Initial mini-batch size​<br>
</p>
<p><span style="font-size:11.5pt;line-height:107%;font-family:"Segoe UI",sans-serif;color:rgb(33,33,33)"><br>
</span></p>
<p><span style="font-family:Calibri,Arial,Helvetica,sans-serif;font-size:16px;background-color:rgb(255,255,255)">Thank you very much for your help.</span><br>
</p>
</div>

_______________________________________________<br>
3dem mailing list<br>
<a href="mailto:3dem@ncmir.ucsd.edu" target="_blank">3dem@ncmir.ucsd.edu</a><br>
<a href="https://mail.ncmir.ucsd.edu/mailman/listinfo/3dem" rel="noreferrer" target="_blank">https://mail.ncmir.ucsd.edu/mailman/listinfo/3dem</a><br>
</blockquote></div>