<div dir="ltr">Hi Kimberley and Steiner,<div><br></div><div>After reading your messages, I looked at some of our old runs. Many of our tomograms have a "pre-tilt" relative to the tilt axis, i.e., the missing wedge is rotated either clockwise or anticlockwise around the tilt axis. I noticed that for one of our runs, the RELION _ctf.mrc file was pre-tilted in the opposite direction relative to the tomo (see attachments). You can see this effect if you open the _ctf.mrc file in IMOD, then flip it around the X axis so that you're viewing down the tilt axis, then compare with the flipped tomogram viewed as a FFT. In principle, this mismatch can make unmeasured parts of a particles' Fourier transform upweighted and the measured parts downweighted. After digging through the auxiliary files, I found that the tomogram in question had a .tlt file in which the angles were ordered from positive to negative. Our other tomograms had .tlt files with angles ordered negative to positive: the _ctf.mrc files in these runs matched the respective missing wedges. I did not see any difference in my subtomogram averages after I corrected this pre-tilt mismatch, but the averages might not have enough resolution to show any artifacts. I'd be curious if anyone else has had this pre-tilt mismatch problem and if correcting for the .tlt file made a difference.</div><div><br></div><div>RELION _ctf.mrc file:</div><div><div><img src="cid:ii_jiv5ovac0_1643a399fbda1595" width="466" height="454"><br></div><div>FFT of tomogram:</div><div><img src="cid:ii_jiv5ovao1_1643a399fbda1595" width="539" height="524"><br></div><br></div></div><div class="gmail_extra"><br clear="all"><div><div class="gmail_signature" data-smartmail="gmail_signature"><div dir="ltr"><div><div dir="ltr"><div><font face="arial, helvetica, sans-serif" size="2"><br></font></div><div><font face="arial, helvetica, sans-serif" size="2">Cheers.</font></div><div><font face="arial, helvetica, sans-serif" size="2">Lu</font></div><div><font size="2" face="arial, helvetica, sans-serif"><br></font></div><font face="monospace, monospace" size="2">--<br>Lu Gan<br>Assistant Professor<br>Department of Biological Sciences<br>Centre for BioImaging Sciences<br>National University of Singapore<br>14 Science Drive 4<br>S1A, Lvl 2<br>Singapore 117543<br><br><a href="http://www.anaphase.org" target="_blank">www.anaphase.org</a></font><div><font face="monospace, monospace" size="2"><br>Tel: (65) 6516 8868<br>Fax: (65) 6776 7882</font><div>
</div></div></div></div></div></div></div>
<br><div class="gmail_quote">On Fri, Jun 8, 2018 at 8:46 PM, Gibson, Kimberley <span dir="ltr"><<a href="mailto:kimberley.gibson@yale.edu" target="_blank">kimberley.gibson@yale.edu</a>></span> wrote:<br><blockquote class="gmail_quote" style="margin:0 0 0 .8ex;border-left:1px #ccc solid;padding-left:1ex">




<div dir="ltr">
<div id="m_-191587953874382001divtagdefaultwrapper" style="font-size:12pt;color:#000000;font-family:Calibri,Helvetica,sans-serif" dir="ltr">
<p style="margin-top:0;margin-bottom:0">Hi Sjors, <br>
</p>
<p style="margin-top:0;margin-bottom:0"><br>
</p>
<p style="margin-top:0;margin-bottom:0">Thank you for the really helpful update. That does sound very promising.
<br>
</p>
<p style="margin-top:0;margin-bottom:0"><br>
</p>
<p style="margin-top:0;margin-bottom:0">Best,<br>
</p><span class="">
<p style="margin-top:0;margin-bottom:0"><br>
</p>
<div id="m_-191587953874382001Signature">
<div dir="ltr" id="m_-191587953874382001divtagdefaultwrapper" style="font-size:12pt;color:rgb(0,0,0);background-color:rgb(255,255,255);font-family:Calibri,Arial,Helvetica,sans-serif,"EmojiFont","Apple Color Emoji","Segoe UI Emoji",NotoColorEmoji,"Segoe UI Symbol","Android Emoji",EmojiSymbols">
<div style="font-family:Tahoma;font-size:13px">Kimberley Gibson<br>
<br>
Research Associate, Charles Sindelar Lab<br>
<br>
Dept. Molecular Biophysics and Biochemistry<br>
Yale University<br>
<br>
</div>
</div>
</div>
</span></div>
<hr style="display:inline-block;width:98%">
<div id="m_-191587953874382001divRplyFwdMsg" dir="ltr"><font face="Calibri, sans-serif" style="font-size:11pt" color="#000000"><b>From:</b> Sjors Scheres <<a href="mailto:scheres@mrc-lmb.cam.ac.uk" target="_blank">scheres@mrc-lmb.cam.ac.uk</a>><br>
<b>Sent:</b> Thursday, June 7, 2018 3:25:24 PM<br>
<b>To:</b> Gibson, Kimberley<br>
<b>Cc:</b> Steinar Halldorsson; <a href="mailto:3dem@ncmir.ucsd.edu" target="_blank">3dem@ncmir.ucsd.edu</a><br>
<b>Subject:</b> Re: [3dem] Missing wedge masking in RELION</font>
<div> </div>
</div>
<div class="m_-191587953874382001BodyFragment"><font size="2"><span style="font-size:11pt">
<div class="m_-191587953874382001PlainText"><div><div class="h5">Hi Kimberley, Steinar,<br>
The way this is done is published: see Bharat et al, Structure 2016.<br>
Kimberley, yes you are right, and we are on this one! We are working with<br>
the Briggs group to generate better 3D CTFs for subsequent use in relion<br>
refinement and classification. Hopefully more about this some time in the<br>
medium-future.<br>
HTH,<br>
Sjors<br>
<br>
<br>
>>From personal experience, after using RELION to perform subvolume<br>
>> averaging on a structure with an extreme preferred orientation - that<br>
>> even tomography would struggle to overcome - I found that RELION did tend<br>
>> to overcompensate the missing wedge. Upon looking at the 3D FTs of our<br>
>> averaged structure, we noticed that much of the Fourier space was filled<br>
>> in and we were rather optimistic about the results. I would approach<br>
>> these results a little more cautiously now as I believe that RELION was<br>
>> blurring together certain features which are now more resolvable using<br>
>> other programs that do apply wedge masking. This is something that could<br>
>> be discussed for future updates to RELION and incorporated into the<br>
>> pipeline, hopefully.<br>
><br>
> Sincerest regards,<br>
><br>
> Kimberley Gibson<br>
><br>
> Research Associate, Charles Sindelar Lab<br>
><br>
> Dept. Molecular Biophysics and Biochemistry<br>
> Yale University<br>
><br>
> ______________________________<wbr>__<br>
> From: 3dem <<a href="mailto:3dem-bounces@ncmir.ucsd.edu" target="_blank">3dem-bounces@ncmir.ucsd.edu</a>> on behalf of Steinar Halldorsson<br>
> <<a href="mailto:steinar.halldorsson@crick.ac.uk" target="_blank">steinar.halldorsson@crick.ac.<wbr>uk</a>><br>
> Sent: Wednesday, June 6, 2018 5:32:58 AM<br>
> To: <a href="mailto:3dem@ncmir.ucsd.edu" target="_blank">3dem@ncmir.ucsd.edu</a><br>
> Subject: [3dem] Missing wedge masking in RELION<br>
><br>
><br>
> Dear Tomography folks<br>
><br>
><br>
> A question regarding sub-tomogram averaging in Relion, how does the<br>
> software treat the missing wedge? Wishful thinking, but does it in any way<br>
> automatically apply a mask to the individual particles? Is there a way (or<br>
> will there be a way in the next versions) to apply such a mask?<br>
><br>
><br>
> Many thanks,<br>
><br>
> Steinar<br>
><br>
> The Francis Crick Institute Limited is a registered charity in England and<br>
> Wales no. 1140062 and a company registered in England and Wales no.<br>
> 06885462, with its registered office at 1 Midland Road London NW1 1AT<br>
> ______________________________<wbr>_________________<br>
> 3dem mailing list<br>
> <a href="mailto:3dem@ncmir.ucsd.edu" target="_blank">3dem@ncmir.ucsd.edu</a><br></div></div>
> <a href="https://urldefense.proofpoint.com/v2/url?u=https-3A__mail.ncmir.ucsd.edu_mailman_listinfo_3dem&d=DwIDAg&c=cjytLXgP8ixuoHflwc-poQ&r=bnQ0oTnqZpcNz9VEgTjc4fmRiedJ6CirfmiszLcsXWE&m=whJiaw_S2S7Xbo1TngFWSUvz7mMoQTe93GgmZW7VkeI&s=G9lgzi0HDHpKGKN-OLkrPBISp33EOHTAgyva3Nf5UJQ&e=" target="_blank">
https://urldefense.proofpoint.<wbr>com/v2/url?u=https-3A__mail.<wbr>ncmir.ucsd.edu_mailman_<wbr>listinfo_3dem&d=DwIDAg&c=<wbr>cjytLXgP8ixuoHflwc-poQ&r=<wbr>bnQ0oTnqZpcNz9VEgTjc4fmRiedJ6C<wbr>irfmiszLcsXWE&m=whJiaw_<wbr>S2S7Xbo1TngFWSUvz7mMoQTe93GgmZ<wbr>W7VkeI&s=G9lgzi0HDHpKGKN-<wbr>OLkrPBISp33EOHTAgyva3Nf5UJQ&e=</a><span class=""><br>
><br>
<br>
<br>
-- <br>
Sjors Scheres<br>
MRC Laboratory of Molecular Biology<br>
Francis Crick Avenue, Cambridge Biomedical Campus<br>
Cambridge CB2 0QH, U.K.<br>
tel: +44 (0)1223 267061<br>
</span><a href="https://urldefense.proofpoint.com/v2/url?u=http-3A__www2.mrc-2Dlmb.cam.ac.uk_groups_scheres&d=DwIDAg&c=cjytLXgP8ixuoHflwc-poQ&r=bnQ0oTnqZpcNz9VEgTjc4fmRiedJ6CirfmiszLcsXWE&m=whJiaw_S2S7Xbo1TngFWSUvz7mMoQTe93GgmZW7VkeI&s=4Ok7FgPrPJs_QTLtUAzfJc5W1OrENc2RK6Bntfd2V9U&e=" target="_blank">https://urldefense.proofpoint.<wbr>com/v2/url?u=http-3A__www2.<wbr>mrc-2Dlmb.cam.ac.uk_groups_<wbr>scheres&d=DwIDAg&c=<wbr>cjytLXgP8ixuoHflwc-poQ&r=<wbr>bnQ0oTnqZpcNz9VEgTjc4fmRiedJ6C<wbr>irfmiszLcsXWE&m=whJiaw_<wbr>S2S7Xbo1TngFWSUvz7mMoQTe93GgmZ<wbr>W7VkeI&s=4Ok7FgPrPJs_<wbr>QTLtUAzfJc5W1OrENc2RK6Bntfd2V9<wbr>U&e=</a><br>
<br>
</div>
</span></font></div>
</div>

<br>______________________________<wbr>_________________<br>
3dem mailing list<br>
<a href="mailto:3dem@ncmir.ucsd.edu">3dem@ncmir.ucsd.edu</a><br>
<a href="https://mail.ncmir.ucsd.edu/mailman/listinfo/3dem" rel="noreferrer" target="_blank">https://mail.ncmir.ucsd.edu/<wbr>mailman/listinfo/3dem</a><br>
<br></blockquote></div><br></div>