<div dir="ltr"><div>Hi Lu,</div><div><br></div><div>I actually have this problem as well, the pre-tilt angle of the CTF mrc file is opposite to the FFT of subtomogram. <br></div><div><br></div><div>Normally it doesn't matter a lot, but if trying to get something relatively high resolution, it will cause some problem... on the other hand, if the pretilt angle is quite high, it will also may cause some trouble...like elongated structure.  I normally just flip the sign of the order file before create the CTF files, wondering if there is other options.<br></div><div><br></div><div>Best</div><div>Qiang<br></div></div><div class="gmail_extra"><br><div class="gmail_quote">2018-06-26 6:01 GMT+02:00  <span dir="ltr"><<a href="mailto:3dem-request@ncmir.ucsd.edu" target="_blank">3dem-request@ncmir.ucsd.edu</a>></span>:<br><blockquote class="gmail_quote" style="margin:0 0 0 .8ex;border-left:1px #ccc solid;padding-left:1ex">Send 3dem mailing list submissions to<br>
        <a href="mailto:3dem@ncmir.ucsd.edu">3dem@ncmir.ucsd.edu</a><br>
<br>
To subscribe or unsubscribe via the World Wide Web, visit<br>
        <a href="https://mail.ncmir.ucsd.edu/mailman/listinfo/3dem" rel="noreferrer" target="_blank">https://mail.ncmir.ucsd.edu/<wbr>mailman/listinfo/3dem</a><br>
or, via email, send a message with subject or body 'help' to<br>
        <a href="mailto:3dem-request@ncmir.ucsd.edu">3dem-request@ncmir.ucsd.edu</a><br>
<br>
You can reach the person managing the list at<br>
        <a href="mailto:3dem-owner@ncmir.ucsd.edu">3dem-owner@ncmir.ucsd.edu</a><br>
<br>
When replying, please edit your Subject line so it is more specific<br>
than "Re: Contents of 3dem digest..."<br>
<br>
<br>
Today's Topics:<br>
<br>
   1. Re: Missing wedge masking in RELION (Lu Gan)<br>
<br>
<br>
------------------------------<wbr>------------------------------<wbr>----------<br>
<br>
Message: 1<br>
Date: Tue, 26 Jun 2018 11:59:46 +0800<br>
From: Lu Gan <<a href="mailto:lu@anaphase.org">lu@anaphase.org</a>><br>
To: "Gibson, Kimberley" <<a href="mailto:kimberley.gibson@yale.edu">kimberley.gibson@yale.edu</a>><br>
Cc: "<a href="mailto:3dem@ncmir.ucsd.edu">3dem@ncmir.ucsd.edu</a>" <<a href="mailto:3dem@ncmir.ucsd.edu">3dem@ncmir.ucsd.edu</a>><br>
Subject: Re: [3dem] Missing wedge masking in RELION<br>
Message-ID:<br>
        <CAPbw-UmN=<a href="mailto:YRETYQiU5vMrhnM2nprDpYqc%2BxLgEAyCGv8akOyhQ@mail.gmail.com">YRETYQiU5vMrhnM2npr<wbr>DpYqc+xLgEAyCGv8akOyhQ@mail.<wbr>gmail.com</a>><br>
Content-Type: text/plain; charset="utf-8"<br>
<br>
Hi Kimberley and Steiner,<br>
<br>
After reading your messages, I looked at some of our old runs. Many of our<br>
tomograms have a "pre-tilt" relative to the tilt axis, i.e., the missing<br>
wedge is rotated either clockwise or anticlockwise around the tilt axis. I<br>
noticed that for one of our runs, the RELION _ctf.mrc file was pre-tilted<br>
in the opposite direction relative to the tomo (see attachments). You can<br>
see this effect if you open the _ctf.mrc file in IMOD, then flip it around<br>
the X axis so that you're viewing down the tilt axis, then compare with the<br>
flipped tomogram viewed as a FFT. In principle, this mismatch can make<br>
unmeasured parts of a particles' Fourier transform upweighted and the<br>
measured parts downweighted. After digging through the auxiliary files, I<br>
found that the tomogram in question had a .tlt file in which the angles<br>
were ordered from positive to negative. Our other tomograms had .tlt files<br>
with angles ordered negative to positive: the _ctf.mrc files in these runs<br>
matched the respective missing wedges. I did not see any difference in my<br>
subtomogram averages after I corrected this pre-tilt mismatch, but the<br>
averages might not have enough resolution to show any artifacts. I'd be<br>
curious if anyone else has had this pre-tilt mismatch problem and if<br>
correcting for the .tlt file made a difference.<br>
<br>
RELION _ctf.mrc file:<br>
<br>
FFT of tomogram:<br>
<br>
<br>
<br>
<br>
Cheers.<br>
Lu<br>
<br>
--<br>
Lu Gan<br>
Assistant Professor<br>
Department of Biological Sciences<br>
Centre for BioImaging Sciences<br>
National University of Singapore<br>
14 Science Drive 4<br>
S1A, Lvl 2<br>
Singapore 117543<br>
<br>
<a href="http://www.anaphase.org" rel="noreferrer" target="_blank">www.anaphase.org</a><br>
<br>
Tel: (65) 6516 8868<br>
Fax: (65) 6776 7882<br>
<br>
On Fri, Jun 8, 2018 at 8:46 PM, Gibson, Kimberley <<a href="mailto:kimberley.gibson@yale.edu">kimberley.gibson@yale.edu</a><br>
> wrote:<br>
<br>
> Hi Sjors,<br>
><br>
><br>
> Thank you for the really helpful update. That does sound very promising.<br>
><br>
><br>
> Best,<br>
><br>
><br>
> Kimberley Gibson<br>
><br>
> Research Associate, Charles Sindelar Lab<br>
><br>
> Dept. Molecular Biophysics and Biochemistry<br>
> Yale University<br>
><br>
> ------------------------------<br>
> *From:* Sjors Scheres <<a href="mailto:scheres@mrc-lmb.cam.ac.uk">scheres@mrc-lmb.cam.ac.uk</a>><br>
> *Sent:* Thursday, June 7, 2018 3:25:24 PM<br>
> *To:* Gibson, Kimberley<br>
> *Cc:* Steinar Halldorsson; <a href="mailto:3dem@ncmir.ucsd.edu">3dem@ncmir.ucsd.edu</a><br>
> *Subject:* Re: [3dem] Missing wedge masking in RELION<br>
><br>
> Hi Kimberley, Steinar,<br>
> The way this is done is published: see Bharat et al, Structure 2016.<br>
> Kimberley, yes you are right, and we are on this one! We are working with<br>
> the Briggs group to generate better 3D CTFs for subsequent use in relion<br>
> refinement and classification. Hopefully more about this some time in the<br>
> medium-future.<br>
> HTH,<br>
> Sjors<br>
><br>
><br>
> >>From personal experience, after using RELION to perform subvolume<br>
> >> averaging on a structure with an extreme preferred orientation - that<br>
> >> even tomography would struggle to overcome - I found that RELION did<br>
> tend<br>
> >> to overcompensate the missing wedge. Upon looking at the 3D FTs of our<br>
> >> averaged structure, we noticed that much of the Fourier space was filled<br>
> >> in and we were rather optimistic about the results. I would approach<br>
> >> these results a little more cautiously now as I believe that RELION was<br>
> >> blurring together certain features which are now more resolvable using<br>
> >> other programs that do apply wedge masking. This is something that could<br>
> >> be discussed for future updates to RELION and incorporated into the<br>
> >> pipeline, hopefully.<br>
> ><br>
> > Sincerest regards,<br>
> ><br>
> > Kimberley Gibson<br>
> ><br>
> > Research Associate, Charles Sindelar Lab<br>
> ><br>
> > Dept. Molecular Biophysics and Biochemistry<br>
> > Yale University<br>
> ><br>
> > ______________________________<wbr>__<br>
> > From: 3dem <<a href="mailto:3dem-bounces@ncmir.ucsd.edu">3dem-bounces@ncmir.ucsd.edu</a>> on behalf of Steinar<br>
> Halldorsson<br>
> > <<a href="mailto:steinar.halldorsson@crick.ac.uk">steinar.halldorsson@crick.ac.<wbr>uk</a>><br>
> > Sent: Wednesday, June 6, 2018 5:32:58 AM<br>
> > To: <a href="mailto:3dem@ncmir.ucsd.edu">3dem@ncmir.ucsd.edu</a><br>
> > Subject: [3dem] Missing wedge masking in RELION<br>
> ><br>
> ><br>
> > Dear Tomography folks<br>
> ><br>
> ><br>
> > A question regarding sub-tomogram averaging in Relion, how does the<br>
> > software treat the missing wedge? Wishful thinking, but does it in any<br>
> way<br>
> > automatically apply a mask to the individual particles? Is there a way<br>
> (or<br>
> > will there be a way in the next versions) to apply such a mask?<br>
> ><br>
> ><br>
> > Many thanks,<br>
> ><br>
> > Steinar<br>
> ><br>
> > The Francis Crick Institute Limited is a registered charity in England<br>
> and<br>
> > Wales no. 1140062 and a company registered in England and Wales no.<br>
> > 06885462, with its registered office at 1 Midland Road London NW1 1AT<br>
> > ______________________________<wbr>_________________<br>
> > 3dem mailing list<br>
> > <a href="mailto:3dem@ncmir.ucsd.edu">3dem@ncmir.ucsd.edu</a><br>
> > <a href="https://urldefense.proofpoint.com/v2/url?u=https-3A__mail" rel="noreferrer" target="_blank">https://urldefense.proofpoint.<wbr>com/v2/url?u=https-3A__mail</a>.<br>
> ncmir.ucsd.edu_mailman_<wbr>listinfo_3dem&d=DwIDAg&c=<wbr>cjytLXgP8ixuoHflwc-poQ&r=<br>
> bnQ0oTnqZpcNz9VEgTjc4fmRiedJ6C<wbr>irfmiszLcsXWE&m=whJiaw_<br>
> S2S7Xbo1TngFWSUvz7mMoQTe93GgmZ<wbr>W7VkeI&s=G9lgzi0HDHpKGKN-<br>
> OLkrPBISp33EOHTAgyva3Nf5UJQ&e=<br>
> ><br>
><br>
><br>
> --<br>
> Sjors Scheres<br>
> MRC Laboratory of Molecular Biology<br>
> Francis Crick Avenue, Cambridge Biomedical Campus<br>
> Cambridge CB2 0QH, U.K.<br>
> tel: +44 (0)1223 267061<br>
> <a href="https://urldefense.proofpoint.com/v2/url?u=http-3A__www2" rel="noreferrer" target="_blank">https://urldefense.proofpoint.<wbr>com/v2/url?u=http-3A__www2</a>.<br>
> mrc-2Dlmb.cam.ac.uk_groups_<wbr>scheres&d=DwIDAg&c=<wbr>cjytLXgP8ixuoHflwc-poQ&r=<br>
> bnQ0oTnqZpcNz9VEgTjc4fmRiedJ6C<wbr>irfmiszLcsXWE&m=whJiaw_<br>
> S2S7Xbo1TngFWSUvz7mMoQTe93GgmZ<wbr>W7VkeI&s=4Ok7FgPrPJs_<br>
> QTLtUAzfJc5W1OrENc2RK6Bntfd2V9<wbr>U&e=<br>
><br>
><br>
> ______________________________<wbr>_________________<br>
> 3dem mailing list<br>
> <a href="mailto:3dem@ncmir.ucsd.edu">3dem@ncmir.ucsd.edu</a><br>
> <a href="https://mail.ncmir.ucsd.edu/mailman/listinfo/3dem" rel="noreferrer" target="_blank">https://mail.ncmir.ucsd.edu/<wbr>mailman/listinfo/3dem</a><br>
><br>
><br>
-------------- next part --------------<br>
An HTML attachment was scrubbed...<br>
URL: <<a href="http://mail.ncmir.ucsd.edu/pipermail/3dem/attachments/20180626/e75bf596/attachment.html" rel="noreferrer" target="_blank">http://mail.ncmir.ucsd.edu/<wbr>pipermail/3dem/attachments/<wbr>20180626/e75bf596/attachment.<wbr>html</a>><br>
-------------- next part --------------<br>
A non-text attachment was scrubbed...<br>
Name: ctf_file.png<br>
Type: image/png<br>
Size: 7132 bytes<br>
Desc: not available<br>
URL: <<a href="http://mail.ncmir.ucsd.edu/pipermail/3dem/attachments/20180626/e75bf596/attachment.png" rel="noreferrer" target="_blank">http://mail.ncmir.ucsd.edu/<wbr>pipermail/3dem/attachments/<wbr>20180626/e75bf596/attachment.<wbr>png</a>><br>
-------------- next part --------------<br>
A non-text attachment was scrubbed...<br>
Name: tomo_fft.png<br>
Type: image/png<br>
Size: 59103 bytes<br>
Desc: not available<br>
URL: <<a href="http://mail.ncmir.ucsd.edu/pipermail/3dem/attachments/20180626/e75bf596/attachment-0001.png" rel="noreferrer" target="_blank">http://mail.ncmir.ucsd.edu/<wbr>pipermail/3dem/attachments/<wbr>20180626/e75bf596/attachment-<wbr>0001.png</a>><br>
<br>
------------------------------<br>
<br>
Subject: Digest Footer<br>
<br>
______________________________<wbr>_________________<br>
3dem mailing list<br>
<a href="mailto:3dem@ncmir.ucsd.edu">3dem@ncmir.ucsd.edu</a><br>
<a href="https://mail.ncmir.ucsd.edu/mailman/listinfo/3dem" rel="noreferrer" target="_blank">https://mail.ncmir.ucsd.edu/<wbr>mailman/listinfo/3dem</a><br>
<br>
<br>
------------------------------<br>
<br>
End of 3dem Digest, Vol 130, Issue 38<br>
******************************<wbr>*******<br>
</blockquote></div><br><br clear="all"><br>-- <br><div class="gmail_signature" data-smartmail="gmail_signature"><div dir="ltr">Qiang (John) Guo<br>Department of Molecular Structural Biology<br>Max Planck Institute of Biochemistry<br>Am Klopferspitz 18<br>82152 Martinsried<br>Germany<br>Email: <a href="mailto:guoq.tiger@gmail.com" target="_blank">guoq.tiger@gmail.com</a> <br></div></div>
</div>