<div dir="ltr">Hi Davide,<div><br></div><div>Counts is not electron dose, but simply a measure of the SNR of the image.  I actually don't know much more about how counts are calculated, but perhaps David can teach us (I would be very interested to learn more!).  You must calibrate the electron dose separately, and this will be reported in the log and recorded in the mdoc.</div><div><br></div><div>This #set target counts variable is the same as the variable in the normal SerialEM tomogram acquisition.  It is an alternative to the 1/cos scheme, where the program looks at the counts in the previous record image and then adjusts the exposure time to try to achieve the target counts in the next record.  If you are going up in tilt (the specimen is getting thicker), this results in increasing exposure times.</div><div><br></div><div>While 1/cos works well for predictable samples, most of the people in our lab use target counts for cellular lamellas, where it is a bit unpredictable how quickly you will have to increase the dose, and where the required dose increases are not the same in the plus and minus directions.</div><div><br></div><div>In practice, what I do is set the record for the exposure time I would like to use in my zero tilt, take a preview image on the sample, and then take a look in the "tilt series setup" dialogue for the predicted counts given my exposure time.  This gives me a feeling for what I can realistically shoot for on a given sample.  On thin cellular lamellas, I can normally get over 120 counts/image while staying under 100 e/A2 total dose.  On thin isolated stuff, I can sometimes get up to 160 or so.  On thicker cellular lamellas, or contaminated lamellas, I am happy to get 100 counts, and am often stuck with only 80.  If the prediction for zero tilt is 50-60 at the maximum electron dose I am comfortable with (1.5-2 for the image), then it simply is too thick and I don't bother.</div><div><br></div><div>Best,</div><div>Ben</div></div><div class="gmail_extra"><br><div class="gmail_quote">On Tue, Jul 11, 2017 at 5:23 PM, Davide Floris <span dir="ltr"><<a href="mailto:dafloris@biophys.mpg.de" target="_blank">dafloris@biophys.mpg.de</a>></span> wrote:<br><blockquote class="gmail_quote" style="margin:0 0 0 .8ex;border-left:1px #ccc solid;padding-left:1ex"><div style="word-wrap:break-word">Dear Ben<div>after reading with a colleague the description (see forwarded message) you sent me, we noticed that the point 2) mentions as “CountTarget” the number of counts per image, while in the script it says #set target counts for tomogram, and the default value is set to 100.</div><div>We are wondering:</div><div>- is the value referred to the single image or to the whole tomogram?</div><div>- is “counts” to be intended as “electrons” or it must be converted into electrons?</div><div><br></div><div>We use a K2 summit in super resolution mode, but don’t know which camera was used to test the script (Falcon, CCD, K2 in linear mode?).</div><div>Could you give us any clarification?</div><div>Best,</div><div><br></div><div>Davide</div><span class=""><div>
______________________________<wbr>___________________<br><br>Davide Floris<br>PhD student<br>Max Planck Institute of Biophysics<br>Structural Biology Department<br>Max-von-Laue Straße 3<br>60438 Frankfurt am Main<br>Germany<br><br>(L2.090): <a href="tel:+49%2069%2063033037" value="+496963033037" target="_blank">+49-69-6303-3037</a><br>(B2.205): <a href="tel:+49%2069%2063033049" value="+496963033049" target="_blank">+49-69-6303-3049</a>
</div>
<br></span><div><blockquote type="cite"><span class=""><div>On 22 May 2017, at 11:27, Ben Engel <<a href="mailto:bdengel@gmail.com" target="_blank">bdengel@gmail.com</a>> wrote:</div><br class="m_-3798022174572526605Apple-interchange-newline"></span><span class=""><div><b style="font-family:TimesNewRomanPSMT;font-style:normal;font-variant-caps:normal;letter-spacing:normal;text-align:start;text-indent:0px;text-transform:none;white-space:normal;word-spacing:0px;font-size:12.8px">Hi Everyone, </b><span style="font-family:TimesNewRomanPSMT;font-style:normal;font-variant-caps:normal;font-weight:normal;letter-spacing:normal;text-align:start;text-indent:0px;text-transform:none;white-space:normal;word-spacing:0px;font-size:12.8px"></span><div style="font-family:TimesNewRomanPSMT;font-style:normal;font-variant-caps:normal;font-weight:normal;letter-spacing:normal;text-align:start;text-indent:0px;text-transform:none;white-space:normal;word-spacing:0px;font-size:12.8px"><br></div><div style="font-family:TimesNewRomanPSMT;font-style:normal;font-variant-caps:normal;font-weight:normal;letter-spacing:normal;text-align:start;text-indent:0px;text-transform:none;white-space:normal;word-spacing:0px;font-size:12.8px">as promised here is a version of the Hagen tilt scheme that I modified so that it can be started at any starting angle.</div><div style="font-family:TimesNewRomanPSMT;font-style:normal;font-variant-caps:normal;font-weight:normal;letter-spacing:normal;text-align:start;text-indent:0px;text-transform:none;white-space:normal;word-spacing:0px;font-size:12.8px"><br></div><div style="font-family:TimesNewRomanPSMT;font-style:normal;font-variant-caps:normal;font-weight:normal;letter-spacing:normal;text-align:start;text-indent:0px;text-transform:none;white-space:normal;word-spacing:0px;font-size:12.8px">For lamellae, the pre tilt is 7 º, i.e. if you’re milling at 18º, 11º stage tilt should be your actual ‘0º’. I routinely use a starting angle of 10º,</div><div style="font-family:TimesNewRomanPSMT;font-style:normal;font-variant-caps:normal;font-weight:normal;letter-spacing:normal;text-align:start;text-indent:0px;text-transform:none;white-space:normal;word-spacing:0px;font-size:12.8px"><br></div><div style="font-family:TimesNewRomanPSMT;font-style:normal;font-variant-caps:normal;font-weight:normal;letter-spacing:normal;text-align:start;text-indent:0px;text-transform:none;white-space:normal;word-spacing:0px;font-size:12.8px">and this results in virtually the same number of counts when tilting +xº and -xº from your actual zero.</div><div style="font-family:TimesNewRomanPSMT;font-style:normal;font-variant-caps:normal;font-weight:normal;letter-spacing:normal;text-align:start;text-indent:0px;text-transform:none;white-space:normal;word-spacing:0px;font-size:12.8px"><br></div><div style="font-family:TimesNewRomanPSMT;font-style:normal;font-variant-caps:normal;font-weight:normal;letter-spacing:normal;text-align:start;text-indent:0px;text-transform:none;white-space:normal;word-spacing:0px;font-size:12.8px"><br></div><div style="font-family:TimesNewRomanPSMT;font-style:normal;font-variant-caps:normal;font-weight:normal;letter-spacing:normal;text-align:start;text-indent:0px;text-transform:none;white-space:normal;word-spacing:0px;font-size:12.8px"><u>The procedure to use the script is as follows:</u></div><div style="font-family:TimesNewRomanPSMT;font-style:normal;font-variant-caps:normal;font-weight:normal;letter-spacing:normal;text-align:start;text-indent:0px;text-transform:none;white-space:normal;word-spacing:0px;font-size:12.8px"><br></div><div style="font-family:TimesNewRomanPSMT;font-style:normal;font-variant-caps:normal;font-weight:normal;letter-spacing:normal;text-align:start;text-indent:0px;text-transform:none;white-space:normal;word-spacing:0px;font-size:12.8px">0) Set up your SerialEM session as usual.</div><div style="font-family:TimesNewRomanPSMT;font-style:normal;font-variant-caps:normal;font-weight:normal;letter-spacing:normal;text-align:start;text-indent:0px;text-transform:none;white-space:normal;word-spacing:0px;font-size:12.8px"><br></div><div style="font-family:TimesNewRomanPSMT;font-style:normal;font-variant-caps:normal;font-weight:normal;letter-spacing:normal;text-align:start;text-indent:0px;text-transform:none;white-space:normal;word-spacing:0px;font-size:12.8px">1) Copy the contents of the file to an empty macro slot and change parameters as needed. (Once you save your settings the script will be there permanently)</div><div style="font-family:TimesNewRomanPSMT;font-style:normal;font-variant-caps:normal;font-weight:normal;letter-spacing:normal;text-align:start;text-indent:0px;text-transform:none;white-space:normal;word-spacing:0px;font-size:12.8px"><br></div><div style="font-family:TimesNewRomanPSMT;font-style:normal;font-variant-caps:normal;font-weight:normal;letter-spacing:normal;text-align:start;text-indent:0px;text-transform:none;white-space:normal;word-spacing:0px;font-size:12.8px">2) Check and adjust AngleOffset (your starting angle), CountTarget (the number of counts you’re asking for each image), step (the angle increment) </div><div style="font-family:TimesNewRomanPSMT;font-style:normal;font-variant-caps:normal;font-weight:normal;letter-spacing:normal;text-align:start;text-indent:0px;text-transform:none;white-space:normal;word-spacing:0px;font-size:12.8px"><br></div><div style="font-family:TimesNewRomanPSMT;font-style:normal;font-variant-caps:normal;font-weight:normal;letter-spacing:normal;text-align:start;text-indent:0px;text-transform:none;white-space:normal;word-spacing:0px;font-size:12.8px">    and tilttimes (how many times the script will do +step -> -step -> -2*step -> +2*step, e.g. for step = 2, tilt times = 15 you will get ±60º around your actual ‘zero’)</div><div style="font-family:TimesNewRomanPSMT;font-style:normal;font-variant-caps:normal;font-weight:normal;letter-spacing:normal;text-align:start;text-indent:0px;text-transform:none;white-space:normal;word-spacing:0px;font-size:12.8px"><br></div><div style="font-family:TimesNewRomanPSMT;font-style:normal;font-variant-caps:normal;font-weight:normal;letter-spacing:normal;text-align:start;text-indent:0px;text-transform:none;white-space:normal;word-spacing:0px;font-size:12.8px">    Make sure you’re not exceeding the stage limits!!!</div><br class="m_-3798022174572526605Apple-interchange-newline"></div></span></blockquote></div><br></div></blockquote></div><br></div>